Determination of structure and backbone dynamics of CsPinA protein and its interactions with model peptides as studied by NMR spectroscopy

Repozytorium Centrum Otwartej Nauki

pl | en
 
 

Pokaż uproszczony rekord

dc.contributor.advisor Ejchart, Andrzej
dc.contributor.author Jaremko, Lukasz
dc.date.accessioned 2012-12-03T09:39:16Z
dc.date.available 2012-12-03T09:39:16Z
dc.date.issued 2012-12-03
dc.identifier.uri http://depotuw.ceon.pl/handle/item/125
dc.description.abstract STRESZCZENIE PRACY W JĘZYKU POLSKIM Wyznaczenie struktury i dynamiki białka CsPin oraz jego oddziaływania z modelowymi peptydami metodami spektroskopii NMR Łukasz Jaremko Opiekunowie: prof. dr hab. Andrzej Ejchart Instytut Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie, Środowiskowe Laboratorium NMR e-mail: aejchart@ibb.waw.pl, tel. (22) 659 20 37 prof. dr hab. Karol Jackowski Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski e-mail: kjack@chem.uw.edu.pl, tel. (22) 822 02 11 w 315 WSTĘP TEORETYCZNY Izomerazy peptydylowo-prolylowe (PPI) są obecne we wszystkich organizmach żywych. Katalizują one proces rotacji wokół wiązania peptydowego (izomeryzację cis - trans) w białkach w układzie Xaa-Pro. W skład tej grupy białek wchodzą cyklofiliny, białka wiążące FK506 oraz parwuliny. Parwuliny są przeważnie małymi białkami bardzo konserwatywnymi ewolucyjnie, występują one zarówno u przedstawicieli królestwa Procaryota jak i Eucaryota. Jak wykazały przeprowadzone dla przedstawicieli królestwa Eucaryota badania, białka z grupy parwulin zaangażowane są między innymi w regulację cyklu komórkowego i kontrolę jakości powstałych w wyniku biosyntezy białek. Proces ten ma szczególne znaczenie, gdyż istnieją uzasadnione podejrzenia, że niektóre niewielkie parwuliny jak białka Pin (Protein Interacting with NINA-kinase) mogą uczestniczyć w pierwszych etapach zwijania białek, odpowiadając za kontrolę ich jakości. Nieprawidłowo zwinięte białka znajdują się obecnie w centrum zainteresowania nauki, gdyż powodują one szereg groźnych chorób zwierząt i ludzi. Przykładem mogą być choroby neurodegeneracyjne: choroby prionowe, Alzheimera czy Parkinsona. W literaturze w przeciągu ostatniej dekady niejednokrotnie wskazywano na powiązania pomiędzy występowaniem ludzkiej parwuliny hPin1 a różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym tauopatiami. Parwulina CsPinA pochodząca z zimnolubnych organizmów, żyjących w zimnych morskich wodach należących do archeonów Cenarchaeum symbiosum, które są symbiontami morskich gąbek z gatunku Axinella mexicana, z powodu swojego uderzającego podobieństwa do ludzkich białek Pin1 oraz Pin14 jest interesującym obiektem do badań funkcjonalnych oraz strukturalnych. Odpowiada ona za izomeryzację wiązania peptydowego w niskich temperaturach, co jest wyjątkowe w świecie przyrody, gdyż wszystkie dotychczas poznane białka z rodziny parwulin aktywne są w znacznie wyższych temperaturach. Parwulina CsPinA katalizuje proces izomeryzacji wiązania peptydowego w temperaturze 10oC, natomiast optymalna temperatura pracy pozostałych obecnie poznanych parwulin wynosi około 30oC i więcej. Dodatkowo niewielkie rozmiary parwuliny CsPinA (92 aa) oraz dobrze zbadane homologiczne białka z innych organizmów ciepłolubnych, sprawiają iż jest ona doskonałym modelowym układem do badania adaptacji niskotemperaturowych oraz wpływu temperatury na strukturę oraz dynamikę funkcjonalną enzymu. ZNACZENIE PROJEKTU Przedstawiony projekt ma przede wszystkim znaczenie poznawcze i pozwoli opisać molekularne różnice między parwulinami wysoko (>30oC) oraz niskotemperaturowymi (~10oC). Otrzymane wyniki nie ograniczą się do jednej klasy enzymów. Z pewnością zainteresują one wielu badaczy zajmujących się reakcjami enzymatycznymi, niejednokrotnie wrażliwymi na niewielkie zmiany temperatury a stanowiącymi podstawę procesów życiowych. Proponowane badania zapewnią wgląd na poziomie molekularnym na zależność między wydajnością pracy enzymu a temperaturą zarówno od strony strukturalnej jak i dokładnej dynamiki procesów katalitycznych. Podsumowując, podstawowym znaczeniem projektu jest zrozumienie często subtelnych różnic w strukturze i dynamice enzymu w warunkach optymalnych dla jego działania oraz odległych od tych warunków. Porównanie wyników uzyskanych dla parwuliny CsPinA aktywnej w niskiej temperaturze z jej bakteryjnymi i ludzkimi odpowiednikami aktywnymi w wyższych temperaturach umożliwi lepsze poznanie sposobów w jaki różne organizmy przystosowały się do życia w skrajnych warunkach termicznych. Wiedza ta może posłużyć do projektowania enzymów pracujących w pożądanych warunkach termicznych, co jest niezmiernie interesujące zarówno dla czystej nauki jak i zastosowań przemysłowych. CELE Cele pracy zostały przedstawione poniżej: I. Badania strukturalne pierwszej parwuliny z Archea z wykorzystaniem wielowymiarowych technik magnetycznego rezonansu jadrowego (NMR): - przypisania sygnałów 1H, 13C oraz 15N łańcucha głównego oraz łańcuchów bocznych CsPinA; - określenie motywów drugorzędowych oraz zwinięcia białka CsPinA; - określenie wysoko rozdziejczej struktury CsPinA w roztworze; II. opis dynamiki łańcucha głównego białka CsPinA w temperaturze fizjologicznej z wykorzystaniem pomiarów magnetycznej relaksacji jąder 15N; III. określenie reszt odpowiedzialnych za wiązanie modelowego peptydu; IV. wpływ temperatury na dynamikę globalną oraz lokalną białka CsPinA; V. przyspieszenie badań dynamiki łańcucha głównego białka formalizmem MFA/EMFA z wykorzystaniem wyłącznie stałych prędkości relaksacji R1 oraz R2 przy wyeliminowaniu czasochłonnych pomiarów {1H}-15N NOE; VI. wyznaczenie parametrów strukturalnych rN-H oraz Δσ(15N) z danych magnetycznej relaksacji jąder 15N białka CsPinA w temperaturze fizjologicznej. STRESZCZENIE Z REALIZACJI CELÓW Wymienione cele zostały zrealizowane. Poniżej zamieszczony jest skrócony opis z realizacji poszczególnych celów pracy. Ad. I. Rysunek 1 | Przypisane widmo 2D 1H-15N HSQC białka CsPinA. Przeprowadzone badania metodami cieczowego magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) pozwoliły rozwiązać i udokładnić wysoko rozdzielczą strukturę pierwszej parwuliny z archeonów. Parwulina CsPinA składa się z 92 aminokwasów. Widma 1H-15N HSQC (Rys. 1) oraz 1H-13C HSQC charakteryzują się doskonałą dyspersją sygnałów co w połączeniu z wielkością białka sprawia, że jest ono idealnym obiektem do badań technikami cieczowego NMR. Wysoko rozdzielcza struktura NMR parwuliny CsPinA wykazała, że białko posiada zwinięcie typu β-α3-β-α-β2 charakterystyczne dla wszystkich znanych dotychczas parwulin. Jedyna różnica dotyczy helisy3, będącej w tym przypadku krótką helisą typu 310 (Rys. 2). Figure 2 | Zwinięcie białka CsPinA z zaznaczonymi strukturami drugorzędowymi. Porównanie pierwszej parwuliny CsPinA z archeonów z jej bakteryjnymi oraz eukariotycznymi odpowiednikami wykazało znacząco większy rozmiar miejsca aktywnego wiązania substratu (Rys. 3). Można to tłumaczyć jako adaptację do pełnienia funkcji izomerazy w niskich temperaturach. Rysunek 3 | Porównanie powierzchni hydrofobowej oraz rozmieszczenia reszt kluczowych dla aktywności enzymatycznej w centrum katalitycznym parwulin: A) C. symbiosum PinA, CsPinA (PDB 2RQS); B) E. coli Par10 (PDB 1JNS); C) H. sapiens Pin1 (PDB 1PIN); oraz D) H. sapiens Par14 (PDB 1EQ3). Promienie wejścia do centrum katalitycznego zostały policzone w programie MolMol; średni błąd wynosi ± 0.35 Å. Ad. II. Pomiary magnetycznej relaksacji 15N (R1, R2, {1H}-15N NOE) wolnego białka CsPinA zostały wykonane dla próbce pojedynczo 15N-znakowanego białka CsPinA o stężeniu ~0.9 mM na spektrometrach o częstotliwości podstawowej 400, 500, 600 i 700 MHz. W przypadku pomiarów {1H}-15N NOE przy 600 MHz oraz 700 MHz przerwy relaksacyjne d1 wynoszące 8 s oraz odpowiednio 12 i 14 s okazały się za krótkie, co zmusiło nas do odrzucenia danych {1H}-15N NOE otrzymanych dla tego pola. Pomiary dla czterech częstotliwości (R1, R2 oraz {1H}-15N NOE, częstotliwości 400, 500, 600 i 700 MHz) zapewniły komplet danych relaksacyjnych, które pozwoliły opisać z wystarczającą dokładnością dynamikę łańcucha głównego z wykorzystaniem modelu Extended Model-Free Approach (EMFA) w 10oC. Rysunek 4 | Reszty wykazujące dynamikę w skali czasowej μs-ms. Badania dynamiki łańcucha głównego białka CsPinA wykazały, że reszty helisy3 (oznaczonej na Rys. 2 jako α3), będącej krótką helisą 310 oraz sąsiedniej pętli wykazują w temperaturze 10°C wyraźną dynamikę w skali mikro do milisekund (Rys. 4 – na rysunku numeracja jest przesunięta o -5 reszt) oraz heterogenność w rodzinie struktur wyznaczonej z danych NMR. Wyniki analizy EMFA otrzymane dla białka CsPinA pozwoliły zidentyfikować reszty charakteryzujące się ruchami w skali mikro do milisekund. Są to następujące reszty aminokwasowe: H14, Q25, F36, G37, D46, S55, V65, K66, E87 oraz F88 (Rys 4). Pokrywają się one z resztami wykazującymi zmiany przesunięć chemicznych po związaniu modelowego peptydu HQSPWNN do białka (Rys. 5). Ad. III. Miareczkowanie białka CsPinA modelowym peptydem wybranym za pomocą fagowej ekspresji peptydów (phage display) potwierdziło znaczenie reszt helisy3 oraz sąsiedniej pętli w procesie wiązania ligandu (Rys. 5), który moduluje ruchliwość helixy3 oraz reszt centrum katalitycznego po związaniu w 10°C. Glicyna oraz dwa dodatnio naładowane aminokwasy obszaru 310-helisy3 i pętli są konserwowane we wszystkich parwulinach, co dodatkowo potwierdza ich znaczenie funkcjonalne dla tej rodziny białek. Wybrane za pomocą fagowej ekspresji peptydów dwa modelowe peptydy HQSPWNN oraz HKRPRNN zostały użyte do miareczkowania podwójnie znakowanego 13C,15N białka CsPinA w proporcjach 1:0, 1:1, 1:4 oraz 1:8 (stosunek molowy białka do peptydu). Peptyd był dodawany do białka w postaci stężonego roztworu o znanym stężeniu w takim samym jak białko buforze w temperaturze fizjologicznej 10oC. Dla wszystkich kroków miareczkowania białka peptydami wykonywane były widma 1H-15N HSQC, a dla dwóch skrajnych punktów wykonane zostały dodatkowo widma 1H-13C HSQC dla obszaru aromatycznego. Analiza uzyskanych profili zaburzeń przesunięć chemicznych grup H/N (chemical shifts perturbation plots) wykazała, że peptyd HQSPWNN oddziałuje specyficznie z białkiem CsPinA. Reszty wykazujące największe zmiany przesunięć chemicznych w wyniku związania peptydu to: V65, G60, K63, G37, G89, F36, G47, F88, G89, S49, G58, G62 (Rys. 5 – na rysunku numeracja jest przesunieta o -5 reszt) znajdujące się wokół miejsca wiązania substratu jak i samym centrum katalitycznym, jak H14 oraz H91 (Rys. 3). Rysunek 5 | Reszty wykazujące zmiany przesunięć chemicznych po dodaniu HQSPWHH. Ad. IV Rysunek 6 | Efektywny czas korelacji białka CsPinA w funkcji temperatury. Zbadano różnice w dynamice funkcjonalnej i strukturze przestrzennej izomerazy CsPinA w różnych temperaturach: w temperaturze optymalnej dla pracy tego enzymu 10°C oraz wysokiej i niższej. Dynamika łańcucha głównego białka CsPinA w polu 9.4 T w temperaturach 1°C, 10°C, 19°C oraz 28°C zmienia się znacząco z temperaturą przy zachowaniu ogólnego upakowania oraz zwinięcia białka (Rys. 6). Badania zmian przesunięć chemicznych protonów amidowych łańcucha głównego w funkcji temperatury pozwoliło zauważyć zmiany na poziomie lokalnym (Rys. 7). Pomiary widm 2D 1H-15N HSQC w funkcji temperatury w przedziale od -1°C do 36°C, wykazały, że powyżej 15°C kilka reszt z centralnej części białka (C12, I15, V26), a powyżej 25°C wiele dodatkowych reszt aminokwasowych, kluczowych dla procesu izomeryzacji w temperaturze 10°C, charakteryzuje się nieliniowym przebiegiem amidowych przesunięć chemicznych w funkcji temperatury. Wskazuje to na zmiany struktury oraz zachodzący proces wymiany chemicznej. Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przez wartości lokalnych parametrów MFA w 28oC, w szczególności wartości charakteryzujące wymianę chemiczną, Rex. Rysunek 7 | A – najstabilniejsze reszty białka CsPinA (kolor niebieski); B - zmiany przesunięć chemicznych amidów łańcucha głównego wybranych reszt aminokwasowych w funkcji temperatury; C – nałożenie sekwencji z zaznaczeniem reszt, których przesunięcia chemiczne protonów amidowych nie są liniowe ze zmianami temperatury. Ad. V Rysunek 8 | Wpływ eliminowania danych {1H}-15N NOE na parametry lokalne. Ponieważ pomiary magnetycznej relaksacji jądrowej w białkach są czasochłonne, szczególnie z powodu mało czułego pomiaru {1H}-15N NOE, który jak pokazały wcześniejsze i nasze badania wymaga stosowania długich przerw relaksacyjnych, ważne stają się nowe metody skrócenia czasu pomiarowego. Wykonanie pomiarów relaksacyjnych dla białka CsPinA w temperaturze 10oC w czterech polach magnetycznych umożliwiło całkowite wyeliminowanie pomiarów {1H}-15N NOE z analizy EMFA (Rys. 8). Zarówno globalne jak i lokalne parametry relaksacyjne otrzymane wyłącznie z zestawu czterech par R1 oraz R2 jak i dodatkowo z pomiarami {1H}-15N NOE okazały się być w granicach błędów identyczne (Rys. 9). Potwierdza to zasadność rezygnacji z danych {1H}-15N NOE i zastąpienia tego eksperymentu pomiarem R1 i/albo R2 w dodatkowym polu. Rysunek 9 | Zgodność między parametrami lokalnymi otrzymanymi z i bez {1H}-15N NOE. Ad.VI Od dawna znany jest fakt, iż parametry strukturalne białek, takie jak długości wiązań N-H oraz anizotropia przesunięcia chemicznego jąder 15N, wykazują zmienność w obrębie spotykanych wartości. Często w analizie danych relaksacyjnych stosuje się uproszczenie polegające na przyjęciu stałych wartości rN-H oraz Δσ15N) dla wszystkich reszt aminokwasowych. Dane relaksacyjne dla CsPinA z czterech pól okazały się wystarczające do wyznaczenia wartości rN-H oraz Δσ15N) dla poszczególnych reszt (Rys. 10). Wyniki te zgadzają się z wynikami otrzymanymi przez innych badaczy odmiennymi metodami. Obserwowana jest ciekawa zależność między wydłużeniem się wiązania N-H a zmniejszeniem wartości Δσ15N). Rysunek 10 | Wyznaczone wartości 15N CSA [Δσ15N)] oraz rN-H białka CsPinA.
dc.rights 10daysAccess
dc.subject izomeryzacja cis-trans wiazania peptydowego
dc.subject zwijanie
dc.subject dynamika
dc.subject struktura białek
dc.subject NMR
dc.title Determination of structure and backbone dynamics of CsPinA protein and its interactions with model peptides as studied by NMR spectroscopy
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.description.eperson lukasz jaremko
dc.contributor.department Wydział Chemii
dc.date.defence 2012-12-05

Plików w tej pozycji

Pliki Rozmiar Format Widok

Nie ma plików powiązanych z tą pozycją.
Teksty doktoratu i recenzji są udostępniane na miejscu w Bibliotece Uniwersyteckiej w Warszawie. Osoby zainteresowane prosimy o kontakt e-mailowy z redakcją Repozytorium UW (repozytorium.buw@uw.edu.pl) lub osobisty poprzez Informatorium Biblioteki Uniwersyteckiej w Warszawie, tel. 22 55 25 178.
Repozytorium nie przesyła obronionych doktoratów e-mailem.

Ta pozycja pokazuje się w tej kolekcji(ach)

Pokaż uproszczony rekord

Szukaj w repozytorium


Szukanie zaawansowane

Przeglądaj

Moje konto

Statystyki