Peptides as functional nanostructures in molecular layers

University of Warsaw Repository

pl | en
 
 

Show simple item record

dc.contributor.advisor Sęk, Sławomir
dc.contributor.author Juhaniewicz, Joanna
dc.date.accessioned 2013-09-23T07:55:59Z
dc.date.available 2013-09-23T07:55:59Z
dc.date.issued 2013-09-23
dc.identifier.uri https://depotuw.ceon.pl/handle/item/334
dc.description.abstract The first goal of the studies presented in this thesis was to investigate the influence of the primary and secondary structure of peptides on the efficiency of mediated electron transfer. For this purpose, six oligopeptides have been synthesized containing from two to five amino acid residues. The peptides were terminated with thiol groups that allowed immobilizing them in the molecular junction system, between the gold substrate and gold STM tip. The peptides were self-assembled on gold and the quality of the monolayers was verified using electrochemical methods and quartz crystal microbalance, which showed that all peptides formed relatively well-packed monolayers. The conductance measurements were divided into two parts. First, the influence of the individual amino acid residues on the efficiency of electron flow was studied. Scanning tunneling spectroscopy measurement revealed that the chemical properties of a single amino acid residue do not affect the overall electron transfer, which proceeds predominantly through the peptide backbone, that is, it is independent of the presence and the structure of side chains. The second part of the conductance experiments was carried out on peptides composed of oligoproline chains. Proline is unique among all naturally occurring amino acids in that way that it possesses a secondary amine group and, consequently, is not able to form intramolecular hydrogen bonds. On the other hand, proline can form a stable secondary structure starting from three proline residues in peptide chains. The formation of the secondary structure by the synthesized chains was confirmed by circular dichroism spectroscopy, which showed that oligoproline chains adopt the structure of polyproline II. Based on the STS measurements, it was concluded that the conductance of oligoproline chains decreases with the increasing length of peptide molecules. Such behavior was interpreted as indicative of the tunneling mechanism of the electron transfer. The tunneling coefficient β determined from conductance experiments was estimated to be 0.45 Å-1 indicating that the electron mediation through polyproline II structure is characterized by a similar effectiveness comparing to α-helical structures. Since in oligoproline chains the network of hydrogen bonds is not formed, the efficient electron transfer results from the conformation of the stiff peptide bridge. This has also indicated that the primarily role of hydrogen bonds in other secondary structures is to act as a structural motif that stabilizes the optimal structure of the peptide backbone. The ability of hydrogen bonds to provide additional pathways for electron transfer seems to be an extra profit. The second goal of the studies described in this dissertation was to examine the influence of the antimicrobial peptide, melittin, on the properties of model lipid membranes. Lipid membranes were composed of three different phospholipids naturally occurring in biological membranes. The phospholipids had the same length of acyl chains but they possessed various polar head groups, which led to different properties of the membranes. Moreover, the role of cholesterol was also verified. First, the interactions of melittin with lipid monolayers were investigated at the air-water interface using Langmuir trough. The studies of mixed monolayers revealed that melittin incorporates in phospholipid membranes, which resulted in the increase in the molecular area. Melittin exerted the fluidizing effect on lipid monolayers, which was manifested by the decreasing value of the compression modulus as well as by the shift and disappearance of phase transitions. However, the melittin-induced changes in the organization of lipid layers were substantially affected either by the charge of the lipid polar headgroup and its physical state, indicating that negatively charged and/or more condensed lipid monolayers are less susceptible to melittin action. Similar results were obtained from stability and maximum insertion pressure experiments, in which melittin was injected into the subphase, under the compressed monolayers. These experiments revealed that the resistance of the lipid membrane to melittin action increases in series: DMPC < DMPG < DMPC:CHOL < DMPS. For further experiments, lipid bilayers were transferred on solid supports by a combination of Langmuir-Blodgett and Langmuir-Schaefer techniques. For electrochemical studies, the membranes were deposited on gold while for AFM imaging mica was used as a solid support. In electrochemical studies, melittin-induced changes in the structure of membranes were monitored using ferricyanides. The extent of the response of lipid membranes to melittin action was identical as in monolayer experiments. DMPC membrane was the most susceptible and it ruptured 30 minutes after the injection of 10μM solution of melittin. However, when melittin concentration was decreased to 1 μM, pore formation was observed and the DMPC membrane did not rupture over 12 hours. This indicates that the mode of action of antimicrobial peptides is substantially influenced by their concentration. The addition of cholesterol to DMPC membrane resulted in formation of a more condensed bilayer that was substantially more resistant to melittin action. Moreover, in case of negatively charged membranes, melittin first adsorbed on the surface due to the electrostatic interactions that hindered the incorporation of peptide into the lipid bilayers. The changes in the structure of the model lipid membranes caused by the presence of melittin were observed using MAC-mode atomic force microscopy. AFM imaging revealed interesting structural features of investigated membranes. The subjection of DMPC membrane to 1 μM solution of melittin resulted in the formation of transient pores, observed 3 hours after peptide addition. Interestingly, after 20-hour-exposure to melittin, the pores disappeared but the ripple phase was observed. The formation of the ripple phase was explained by the translocation of water and melittin molecules through the membrane during the pore formation, which led to the uprising of the DMPC bilayer. Surprisingly, the ripple phase was also observed upon the injection of melittin to DMPS membrane. However, in this case the formation of the ripple phase was observed virtually right after the addition of the peptide and remained stable over several hours and it was not preceded by pore formation. It should be noted here that the ripple phase has never been observed for pure DMPS membranes. Such behavior of DMPS bilayer can be explained by the fact that the lipid membrane did not remain in a direct contact with the substrate surface, since mica was modified with APTES molecules prior to the transfer of the lipid bilayer. Moreover, the strong adsorption of melittin on DMPS surface may induce packing frustrations that led to the formation of the ripple phase. Since melittin exhibits strong influence on zwitterionic membranes, it cannot be considered as a potential medicine but it provides an excellent tool to study the influence and the mode of action of antimicrobial peptides on biological membranes.
dc.description.abstract Pierwszym celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu pierwszo- i drugorzędowej struktury peptydu na efektywność mediowanego transportu elektronów. Aby go zrealizować, zsyntezowano sześć oligopeptydów zawierających od dwóch do pięciu reszt aminokwasowych. Każdy z peptydów posiadał końcowe grupy tiolowe, które umożliwiały ich unieruchomienie w układzie złącza tunelowego, pomiędzy złotym substratem a złotą igłą skaningowego mikroskopu tunelowego (STM). Monowarstwy peptydów były otrzymywane metodą samoorganizacji z roztworu, a ich jakość była weryfikowana przy użyciu metod elektrochemicznych oraz mikrowagi kwarcowej. Badania te wykazały, że wszystkie peptydy tworzą monowarstwy charakteryzujące się wysokim upakowaniem cząsteczek na powierzchni złotego substratu. Kolejnym etapem były pomiary przewodności, które zostały podzielone na dwie części. Najpierw zbadano wpływ poszczególnych aminokwasów łańcucha peptydowego na efektywność przeniesienia elektronu. Pomiary metodą skaningowej spektroskopii tunelowej (STS) wykazały, że właściwości chemiczne poszczególnych aminokwasów nie wpływają na transport elektronów, który zachodzi głównie przez wiązania amidowe peptydu, czyli jest niezależny od struktury i właściwości łańcuchów bocznych aminokwasów. Druga część pomiarów przewodności została przeprowadzona na peptydach zawierających od jednej do czterech reszt prolinowych. Prolina jest jedynym aminokwasem, spośród wszystkich naturalnie występujących, posiadającym drugorzędową grupę aminową, co uniemożliwia jej tworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych. Z drugiej strony, prolina tworzy stabilne struktury drugorzędowe już od trzech reszt prolinowych w łańcuchu peptydowym. Tworzenie wspomnianej struktury drugorzędowej w zsyntezowanych peptydach zostało potwierdzone badaniami metodą spektroskopii dichroizmu kołowego, które wykazały, że zsyntezowane łańcuchy oligoprolinowe przyjmują strukturę poliproliny II. Na podstawie pomiarów przewodności stwierdzono, że efektywność transportu elektronowego przez łańcuchy oligoprolinowe maleje wraz ze wzrastającą długością peptydu. Zależność ta wskazuje, że dominującym mechanizmem przeniesienia elektronu przez badane układy jest mechanizm tunelowania. Wyznaczony z pomiarów przewodności współczynnik tunelowania wynosił 0.45 Å-1. Stwierdzono zatem, że efektywność przeniesienia elektronu przez łańcuchy peptydowe o strukturze poliproliny II jest podobna do efektywności obserwowanej dla układów α-helikalnych. Jak już wspomniano, prolina nie tworzy wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych, zatem efektywny transport elektronów spowodowany jest konformacją sztywnego łańcucha oligoprolinowego. Wyniki te pozwalają również wyciągnąć wniosek, że podstawową rolą wiązań wodorowych w innych strukturach drugorzędowych jest stabilizowanie optymalnej struktury łańcucha peptydowego, a dostarczanie dodatkowych ścieżek tunelowanie jest dodatkowym profitem. Drugim celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu peptydu antybiotykowego, melityny, na właściwości modelowych błon lipidowych zbudowanych z trzech różnych fosfolipidów naturalnie występujących w błonach biologicznych. Badane fosfolipidy miały taką samą długość i budowę łańcuchów acylowych, różniły się natomiast budową grup polarnych, co umożliwiło tworzenie modelowych błon lipidowych o różnych właściwościach. Zweryfikowano również wpływ cholesterolu na działanie melityny. W pierwszym etapie badano oddziaływania melityny z monowarstwami lipidów na granicy faz woda-powietrze przy użyciu wanny Langmuira. Eksperymenty przeprowadzone na monowarstwach mieszanych wykazały, że melityna wbudowuje się w warstwy lipidowe, co prowadzi do wzrostu powierzchni przypadającej na pojedynczą cząsteczkę. Na postawie zmniejszającego się współczynnika ściśliwości, jak również przesunięcia lub zaniku przejść fazowych stwierdzono, że melityna upłynnia warstwy lipidowe. Jednak zmiany w strukturze modelowych błon wywołane przez melitynę były zależne zarówno od ładunku polarnej głowy jak i stanu fizycznego lipidu, co doprowadziło do wniosku, że lipidy naładowane ujemnie i/lub będące w fazie bardziej skondensowanej są mniej podatne na działanie melityny. Podobne wyniki otrzymano z pomiarów maksymalnego ciśnienia wnikania melityny, w których peptyd wstrzykiwany był do subfazy, pod skompresowaną monowarstwę lipidową. Eksperymenty te wykazały, że oporność lipidów na działanie melityny rośnie w szeregu: DMPC < DMPG < DMPC:CHOL < DMPS. Do dalszych eksperymentów przeniesiono dwuwarstwy lipidowe na substraty stałe poprzez kombinację dwóch metod: Langmuira-Blodgett oraz Langmuira-Schaefera. Dwuwarstwy przeniesione na substrat złoty badane były elektrochemicznie, podczas gdy dwuwarstwy przeniesione na mikę obrazowano przy użyciu mikroskopu sił atomowych (AFM). W pomiarach elektrochemicznych wpływ melityny na dwuwarstwy lipidowe monitorowany był przy użyciu heksacyjanożelazianów, potwierdzając wyniki otrzymane na granicy faz woda-powietrze. Dwuwarstwa zbudowana z DMPC była najbardziej podatna na działanie melityny i ulegała zniszczeniu pod wpływem 10 µM roztworu melityny. Jednak gdy stężenie peptydu obniżono do 1 µM, melityna powodowała tworzenie porów w błonie DMPC, nie prowadząc do jej zniszczenia nawet po 12 godzinach działania melityny. Wyniki te wskazują, że sposób działania peptydów antybiotykowych silnie zależy od ich stężenia. Dodanie cholesterolu (30%) do dwuwarstwy DMPC spowodowało powstanie bardziej skondensowanego układu, który był znacznie bardziej oporny na działanie melityny. Ponadto, w przypadku lipidów naładowanych ujemnie najpierw obserwowano adsorpcję peptydu na powierzchni dwuwarstw lipidowych wskutek oddziaływań elektrostatycznych, co w rezultacie utrudniało wbudowywanie się melityny w błonę lipidową. Zmiany w strukturze modelowych błon lipidowych pod wpływem melityny były również obserwowane przy użyciu mikroskopu sił atomowych w trybie MAC. Poddanie dwuwarstwy DMPC działaniu 1 µM roztworu melityny prowadzi do powstania porów, obserwowanych trzy godziny po dodaniu melityny. Jednak po 20 godzinach od dodania melityny pory nie były widoczne, natomiast obserwowano charakterystyczną pofalowaną strukturę fazy lipidowej Pβ’ (ang. ripple phase). Istnienie tej fazy spowodowane było przemieszczeniem się cząsteczek wody i melityny przez dwuwarstwę lipidową podczas tworzenia porów, które oddzieliły błonę DMPC od powierzchni miki. Faza Pβ’ została również zaobserwowana po dodaniu melityny do dwuwarstwy DMPS. Jednak w tym przypadku zmiany w strukturze błony obserwowane były natychmiast po dodaniu melityny, bez uprzedniego tworzenia przejściowych porów, i pozostawały niezmienne przez wiele godzin. Stwierdzono, że tworzenie struktury Pβ’ wynika z braku bezpośredniego kontaktu substratu z dwuwarstwy, gdyż podłoże przed przeniesieniem dwuwarstwy DMPS zostało zmodyfikowane (3-aminopropylo)trietoksysilanem. Ponadto, silna adsorpcja melityny na powierzchni błony DMPS może powodować zmiany w upakowaniu cząsteczek DMPS, a w konsekwencji prowadzić do powstania fazy Pβ’. Silne działanie melityny na lipidy występujące w komórkach eukariotycznych wydaje się wykluczać możliwość jej wykorzystania jako potencjalnego leku; stanowi ona jednak doskonałe narzędzie do badania wpływu i sposobu działania peptydów antybiotykowych na błony biologiczne.
dc.language.iso en
dc.rights 10daysAccess
dc.subject molecular imaging
dc.subject electrochemistry
dc.subject antimicrobial peptides
dc.subject peptides
dc.subject model lipid membranes
dc.subject obrazowanie molekularne
dc.subject elektrochemia
dc.subject peptydy antybiotykowe
dc.subject peptydy
dc.subject modelowe błony biologiczne
dc.title Peptides as functional nanostructures in molecular layers
dc.title.alternative Peptydy jako funkcjonalne nanostruktury w warstwach molekularnych
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.description.eperson Joanna Juhaniewicz
dc.contributor.department Wydział Chemii
dc.date.defence 2013-10-04

Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.
PhD theses and reviews are only available on-site at the University of Warsaw Library. If you are interested in reading this text on-site please contact us by e-mail: repozytorium.buw@uw.edu.pl.
Repository do not send PDF copy of theses by e-mail.

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search Repository


Advanced Search

Browse

My Account

Statistics